二手液相色譜 法之 手性色譜法
不少有機藥物的結構中有不對稱碳原子，又稱手性碳原子，有手性碳原子的藥物具有旋光性。立體構型不同的一對對映體，其藥效、毒副作用往往不相同。例如抗高血壓藥物a -甲基多巴是S-(-)體;又如氯霉素(含有二個手性碳原子)，只有D-(-)異構體有效。而L-(+)異構體完全無效。沙利度胺(反應停)的兩個對映體對小鼠鎮靜作用的效價相近，但只有左旋異構體才有胚胎毒及致畸作用。因此，對映體的分離，在藥物的制備和質量控制方面，都具有重要的意義。對映體在普通條件下的理化性質是相同的，因此分離對映體需要在手性條件下進行。分離對映體的色譜方法稱為手性色譜法。二手液相色譜法之手性色譜法分為間接法和直接法兩種。間接法是將對映體與一定的手性衍生化試劑反應，使其由對映體轉變為非對映體，再利用他們理化性質的差異，用-般的色譜條件進行分離。直接法不需作衍生化反應，直接利用手性色譜柱或手性流動相進行分離，應用較多，以下主要介紹二手液相色譜法之手性色譜法的直接法。

1手性固定相
手性藥物拆分前的對映體通常以鏡象存在，即以外消旋體形式存在。用常規分析和制備方法不能將其拆分，需引入不對稱( 即手性)環境，使欲拆分的對映體(樣品)、 手性作用物(比如固定相)和手性源形成一個非對映異構分子的絡合物。為了形成這樣一種分子絡合物，分子之間要有-種同時相互存在的作用力，以保持分子的空間定位。Dalgliesh 認為至少要有三個作用力，其中一個要有立體選擇性，可以是吸引的，也可以是排斥的。這就是“三點相互作用”理論。如果對映體中某一種對映體正好與此三個作用點配對，相互作用較強，保留時間就長。而另一種對映體因空間構成不同，不能完全配對，作用相對較弱，保留時間就短，從而可以得到分離。固定相的作用可以是氫鍵、偶極一偶極作用、π_π作用、靜電作用、疏水作用或空間作用等。
常用的手性固定相有以下幾種：
(1)Pirkle型手性固定相
Pickle型手性固定相是由美國學者Pirkle主持研制的，主要有π -堿性(斥電子基)手性固定相和π酸性(吸電子基)手性固定相。在分離的過程中，化合物與固定相之間發生π-π電荷轉移相互作用，此類固定相為電荷轉移型手性固定相。如DNBPG-CSP是把(R)-N3，5-二硝基苯甲酰苯基甘氨酸( dinitrobenzy1 phenylglycin) 鍵合到氨丙基硅膠上。
(2)蛋白質類手性因定相
蛋白質是由手性亞基團氨基酸組成的大分子物質，蛋白質類手性固定相是將蛋白質通過氨基酸鍵合到硅膠上而制成的。常用的蛋白質類手性固定相有牛血清蛋白(RSA)和人血a1-酸性糖蛋白(AGP) 的手性固定相，商品有Chiral AGP, Resolvosil, Enantio Pac等 。蛋白質類手性固定相應用范圍較廣，效果良好，但該類固定相的譜柱容里較小。常用洗脫系統是磷酸鹽緩沖溶液(PH4~7)， 離子強度為0~ 500mmol,有機改性劑不得超過5%。用蛋白質類手性固定相拆分酸性和堿性傾倒物對映體時，流動相內可分別加少童離子對試劑，如.N,N-二甲基辛胺，叔丁胺氫溴酸鹽和辛酸，以獲得理想的分離結果。
(3)多糖類手性固定相
多糖類手性固定相中應用最多的是環糊精。環糊精(cyclodextrin, CD)是一類環形寡聚糖，為手性高分子物質，根據分子中葡萄糖單元的個數不同，環糊精可分為a、β、γ三類，他們分別由6、7、8個D_吡喃葡萄糖組成，將CD分別通過硅烷鏈連接在硅膠表面就構成環糊精手性固定相。環糊精分子成錐桶狀，內腔的直徑由組成環糊精的葡萄糖個數決定，如常用的_環糊精由7個葡萄糖分子組成，內腔直徑為0.8nm。用環糊精手性固定相進行分離時，首先要求被拆分的組分進人洞穴，形成包合物，保留時間以組分能否進人洞穴及其緊密的程度而定，環糊精環上還有多個手性中心，能選擇性地與對映體作用，從而導致對映異構體的保留不同而被分離。如用β-環糊精手性固定相已經成功地分離了二茂鐵等金屬有機絡合物、氨基酸以及生物堿等。除環糊精外，多糖類的手性固定相還可以用纖維素、直鏈淀粉作成，如纖維素三醋酸醋手性固定相、纖維素三苯甲酸醋手性固定相和纖維素氨基甲酸酯手性固定相等。
(4)冠醚(Grown ether) 類手性固定相.
冠醚與環糊精類似，是本身具有手性的低聚糖，是含醚鍵的環狀化合物，呈王冠狀結構，外層是親脂性的乙撐基，環的內層是富電子的雜原子，如氧、氮、硫等。通常使用的是18-冠-6的衍生物，健合在聚苯乙煒骨架或硅膠上，形成冠醚手性固定相。用冠醚手性固定相分離對映體時，不同對映異構體因與冠醚環腔形成的主客體絡合物的穩定性不同而被分離。在冠醚上引人雙萘基，雙萘基可以形成“手性墻”增加固定相的立體選擇性。能質子化的氨基化合物，特別是氨基酸對映體在冠醚手性固定相上可以得到很好的分離。

  2.手性流動相拆分法
手性流動相拆分法是將手性試劑添加到流動相中，利用手性試劑與對映異構體結合的穩定常數不同或結合物在固定相上分配的差異進行分離。近年來，手性流動相拆分法已廣泛應用于藥物對映體的拆分。此法的最大優勢在于:可采用普通的非手性固定相，不需對樣品.進行衍生化，手性添加物本身可流出，也可更換，同時添加物的可變范圍較寬，穩定性好，且價格便宜。
(1)配體交換型手性添加劑
配體交換型手性添加劑由手性配基和含二價金屬離子的鹽組成o手性配基多為具有光學活性的氨基酸及其衍生物，他們和二價金屬離子螯合，分布于流動相中，遇到待分離的對映異構體時，即形成配合物，再在流動相和固定相之間分配而實現分離。分離的機理-般認為.是配基和金屬離子形成的螯合物被吸附在固定相上，形成動態的手性固定相而發揮作用。也可以看成是手性配基、金屬離子和對映異構體形成的配合物穩定常數不同而產生分離o采用5µm粒徑的C18固定相，阿司帕坦作為CMPA，與硫酸銅絡合，測定高血溶素患者尿中D-和L-2-哌啶酸的濃度。
(2)環糊精添加劑
環糊精在水中有-定的溶解度，用環糊精作為手性添加劑，加入流動相中，其分離機理與環糊精手性固定相相同,但保留行為正好相反。對映異構體與環糊精形成的包合物穩定性越強，隨流動相出柱越快，保留時間越短。
(3)手性離于對添加劑
解離的有機化合物能與含互補電荷的試劑相互作用，生成電中性離子對。分離帶電荷的對映異構體時，可以在流動相中添加手性的離子對試劑，對映異構體和離子對試劑形成電中性的離子對,離子對在固定相和流動相間分配系數不同而得到分離。常用的手性離子對試劑有(+)10-樟腦磺酸、奎寧等。