在色譜分析中，如何選擇最佳的色譜條件以實現最理想分離，是色譜工作者的重要工作，也是用計算機實現HPLC分析方法建立和優化的任務之一.以下是HPLC-固定相和流動相的選擇。

固定相

將有機官能團通過化學反應共價鍵合到硅膠表面的游離羥基上而形成的固定相稱為化學鍵合相。這類固定相的突出特點是耐溶劑沖洗，并且可以通過改變鍵合相有機官能團的類型來改變分離的選擇性。

HPLC-固定相的選擇

分離中等極性和極性較強的化合物可選擇極性鍵合相。氰基鍵合相對雙鍵異構體或含雙鍵數不等的環狀化合物的分離有較好的選擇性。氨基鍵合相具有較強的氫鍵結合能力，對某些多官能團化合物如甾體、強心甙等有較好的分離能力；氨基鍵合相上的氨基能與糖類分子中的羥基產生選擇性相互作用，故被廣泛用于糖類的分析，但它不能用于分離羰基化合物，如甾酮、還原糖等，因為它們之間會發生反應生成Schiff 堿。二醇基鍵合相適用于分離有機酸、甾體和蛋白質。

分離非極性和極性較弱的化合物可選擇非極性鍵合相。利用特殊的反相色譜技術，例如反相離子抑制技術和反相離子對色譜法等，非極性鍵合相也可用于分離離子型或可離子化的化合物。ODS(octadecyl silane)是應用最為廣泛的非極性鍵合相，它對各種類型的化合物都有很強的適應能力。短鏈烷基鍵合相能用于極性化合物的分離，而苯基鍵合相適用于分離芳香化合物。

流動相

一個理想的液相色譜流動相溶劑應具有低粘度、與檢測器兼容性好、易于得到純品和低毒性等特征。

選好填料（固定相）后，強溶劑使溶質在填料表面的吸附減少，相應的容量因子k降低；而較弱的溶劑使溶質在填料表面吸附增加，相應的容量因子k升高。因此，k值是流動相組成的函數。塔板數N一般與流動相的粘度成反比。

選擇流動相時應考慮以下幾個方面：

①流動相應不改變填料的任何性質。低交聯度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時遇到某些有機相會溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質。堿性流動相不能用于硅膠柱系統。酸性流動相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統。

②純度。色譜柱的壽命與大量流動相通過有關，特別是當溶劑所含雜質在柱上積累時。

③必須與檢測器匹配。使用UV檢測器時，所用流動相在檢測波長下應沒有吸收，或吸收很小。當使用示差折光檢測器時，應選擇折光系數與樣品差別較大的溶劑作流動相，以提高靈敏度。

④粘度要低（應<2cp）。高粘度溶劑會影響溶質的擴散、傳質，降低柱效，還會使柱壓降增加，使分離時間延長。最好選擇沸點在100℃以下的流動相。

⑤對樣品的溶解度要適宜。如果溶解度欠佳，樣品會在柱頭沉淀，不但影響了純化分離，且會使柱子惡化。

⑥樣品易于回收。應選用揮發性溶劑。

HPLC-流動相的選擇

在化學鍵合相色譜法中，溶劑的洗脫能力直接與它的極性相關。在正相色譜中，溶劑的強度隨極性的增強而增加；在反相色譜中，溶劑的強度隨極性的增強而減弱。

正相色譜的流動相通常采用烷烴加適量極性調整劑。

反相色譜的流動相通常以水作基礎溶劑，再加入一定量的能與水互溶的極性調整劑，如甲醇、乙腈、四氫呋喃等。極性調整劑的性質及其所占比例對溶質的保留值和分離選擇性有顯著影響。一般情況下，甲醇-水系統已能滿足多數樣品的分離要求，且流動相粘度小、價格低，是反相色譜最常用的流動相。但Snyder則推薦采用乙腈-水系統做初始實驗，因為與甲醇相比，乙腈的溶劑強度較高且粘度較小，并可滿足在紫外185~205nm處檢測的要求，因此，綜合來看，乙腈-水系統要優于甲醇-水系統。

在分離含極性差別較大的多組分樣品時，為了使各組分均有合適的k值并分離良好，也需采用梯度洗脫技術。